دستورالعمل جداسازی RNA از مایعات بیولوژیک (RNA Extraction)

کد سند:
412
کد یکتا:
171
واحد سازمانی:
ژنتیک و بیولوژی مولکولی
فرآیند:
فرآیند انجام آزمایش
زمان ویرایش:
1395/01/24
ویرایش کننده:
مدیر ارشد آزمایشگاه
شماره بازنگری:
1.0
ضمیمه - مرجع:
توضیحات:

متن سند:

RNA Extraction

هدف :

انجام روش صحیح  جداسازی RNA   از مایعات بیولوژیک می باشد.

دامنه کاربرد :
این دستورالعمل جهت جداسازی RNA از مایعات بیولوژیک نظیر سرم، پلاسما، ادرار، مایع مغزی-نخاعی، مغز استخوان و نمونه های تهیه شده بوسیله سوآب در بخش تشخیص مولکولی و PCR آزمایشگاه کاربرد دارد.


صلاحیت و شایستگی کاربر :
4-4 –  از آنجاییکه از این دستگاه در حوزه عملکردی بخش تشخیص مولکولی استفاده می گردد لذا تمامی موارد مربوط به صلاحیت و شایستگی پرسنل بخش تشخیص مولکولی می بایست رعایت گردد .
4-5 – جهت حصول اطمینان از  انجام روش صحیح جداسازی RNA   توسط پرسنل بخش تشخیص مولکولی ، قرائت کامل این دستــور العمل  همراه با گذراندن دوره آموزشی به مدت یک هفته تحت نظر مسئول بخش الزامی است

اقدامات وابسته :
- آگاهی از اساس جداسازی اسیدهای نوکلئیک
- آگاهی از عوامل جداسازی اسیدهای نوکلئیک و نیز عوامل مداخله گر
- آگاهی از برنامه کنترل کیفی در آزمایشگاه
- آگاهی از روشهای محلول سازی در آزمایشگاه
-آگاهی از نحوه نگهداری نمونه ها پس از انجام آزمایش
 
اطلاعات نمونه :
-نوع نمونه : باتوجه به کیت های مصرفی جهت استخراج اسید نوکلئیک انواع نمونه های مورد گزارش عبارتند از:
- نمونه سرم غیر همولیز فاقد فیبرین که ترجیحا لیپمیک هم نباشد، برای جداسازی سرم نمونه خون بیمار را که در لوله لخته ژل دار SST  گرفته شده است به مدت 5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ نمایید و بدون استفاده از سمپلر سرم را جدا نموده و داخل یک لوله پلاستیکی نو شفاف درب دار که برای این منظور قبلا استریل شده است نگهداری نمایید.
-نمونه پلاسما غیر همولیز که ترجیحا لیپمیک هم نباشد برای جداسازی پلاسما نمونه خون بیمار را که در لوله محتوی ضد انعقاد EDTA یا سیترات گرفته شده است (ضد انعقاد هپارین برای آزمایش های مولکولی و PCR قابل قبول نمی باشد) به مدت  5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ نمایید و با استفاده از سمپلر، پلاسما را جدا نموده و داخل یک لوله پلاستیکی نو شفاف درب دار که برای این منظور قبلا استریل شده است نگهداری نمایید.
- نمونه ادرار تصادفی یا 24 ساعته که ترجیحا سانتریفوژ شده باشد .
-نمونه خلط و سایر مایعات بیولوژیک
-نمونه خون کامل
-سلول های تک هسته ای جدا شده از خون محیطی(PBMC)
-نمونه بیوپسی از بافت های مختلف
توجه: مایعات بیولوژیک نظیر ادرار، CSF، مغز استخوان و نمونه های گرفته شده توسط سوآب قبل از هر چیز می بایست    به مدت  5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ گردند و مایع حاصل رویی که فاقد سلول است مورد آزمایش قرار بگیرد.
- شرایط ظاهری نمونه :
- نمونه سرم یا پلاسما باید فاقد همولیز بوده و در صورت لیپمیک یا ایکتریک بودن ، در نتیجه نهایی قید گردد .
- نمونه ادرار می بایست شفاف بوده و در غیر اینصورت سانتریفوژ گردد .
-حجم نمونه  :
- حجم نمونه جهت انجام PCR با توجه به دستورالعمل کیت مربوطه تعیین می شود.
 -نحوه ذخیره سازی نمونه :
شرایط نگهداری نمونه با توجه به نوع نمونه و دستورالعمل کیت مربوطه تعیین می شود.
 
تجهیزات و لوازم مورد نیاز :
 
-لوله های پلاستیکی نو درب دار استریل
- سمپلرهای اختصاصی ( مخصوص Extraction ) در سایزهای مختلف
-  سر سمپلر ترجیحا  از نوع فیلتردار و فاقد DNA, RNA
- میکروتیوب های استریل و فاقد DNA, RNA با حجم 1.5ml
-میکروسانتریفوژ ترجیحا یخچال دار
-هود بیولوژیک اختصاصی مجهز به فن قوی و لامپ UV
-Dry-Block  با قابلیت تنظیم در دمای مختلف
- ورتکس
- پیپت فیلر اتوماتیک
- پیپت های 5 تا 10 سی سی استریل
- دستکش
- رک میکروتیوب اختصاصی
- ماژیک اختصاصی
- ظرف Safty Box  اختصاصی
 
-محلول های مورد نیاز و شرایط نگهداری آنها :
- اتانول با درجه خلوص 100-96  درصد که به صورت تجاری در دسترس می باشد.
- اتانول با درجه خلوص 70  درصد که به صورت تجاری در دسترس است.
- سدیم هیپوکلریت (آب ژاول) با غلظت 5 درصد که برای تهیه آن آب ژاول را که به صورت تجاری در دسترس می باشد با استفاده از آب دیونیزه استریل به میزان 20/1 رقیق می نماییم، این محلول ناپایدار بوده و می بایست در هنگام نیاز تهیه شود.
- سدیم هیپوکلریت (آب ژاول) با غلظت 5/0 درصد که برای تهیه آن آب ژاول را که به صورت تجاری در دسترس می باشد با استفاده از آب دیونیزه استریل به میزان 200/1 رقیق می نماییم، این محلول ناپایدار بوده و می بایست در هنگام نیاز تهیه شود.
 
اساس کار کیت DNA Extraction:
مرحله استخراج  RNA خود از 5 مرحله تشکیل می گردد:
1-   مرحله Lyse  : در این مرحله RNA  ویروس به سرعت و به طور کامل توسط بافر RAV1  که در اصل محلول غلیظی از GITC(guanidine thiocyanate) می باشد، لیز می گردد.
2-   مرحله Adjust RNA  : در این مرحله با افزودن اتانول به محلول قبلی حاصل از لیز، شرایط لازم جهت باند شدن اسیدهای نوکلئیک به دیواره سیلیکایی ستون Ribo virus فراهم می گردد.
3-   مرحله Bind: در این مرحله Carrier RNA  موجود در بافر RAV1 ، اتصال اسیدهای نوکلئیک به دیواره سیلیکایی ستون را شدت بخشیده و کلیه مقادیر جزئی RNA ویروس را به دیواره ستون می چسباند.
4-   مرحله Wash: در این مرحله با افزودن بافر های اتانولی RAW  و RAV3 کلیه اضافات و آلودگی ها نظیر نمک ها، متابولیت هاو اجزاء سلولی ماکرومولکولی محلول در نمونه به تدریج شسته و از محیط حذف می گردند.
5-   مرحله Elute: در این مرحله با افزودن Rnase free H2O، اسیدهای نوکلئیک چسبیده به دیواره ستون Ribo Virus  جدا گردیده و جمع آوری می گردند.   
 
روش انجام آزمایش:
- به تعداد مورد نیاز میکرتیوب درب دار  1.5 ml بر روی راک قرار می دهیم.
یک میکرو تیوب برای Negative control of extraction
دو میکروتیوب برای positive control of extraction
به تعداد بیماران هم میکروتیوب می گذاریم.
- مقدار lμ600 از بافر RAV1  حاوی Carrier RNA  به کلیه میکروتیوب ها اضافه می کنیم.
- مقدار lμ 10 از Internal control به میکروتیوب ها اضافه می نماییم.
- مقدار lμ100 از Negative Control  به میکروتیوب Negative اضافه می کنیم.
- مقدار lμ90 از Negative Control به میکروتیوب Positive Control 1  اضافه می نماییم، سپس مقدار lμ10 از              HCV Rec pos1  را به همین میکروتیوب اضافه می کنیم.
 - مقدار lμ90 از Negative Control به میکروتیوب Positive Control 2  اضافه می نماییم، سپس مقدار lμ10 از              HCV Rec pos2  را به همین میکروتیوب اضافه می کنیم.
- مقدار lμ150 سرم بیمار را به هر میکروتیوب مربوط به همان بیمار اضافه می نماییم.
- کلیه میکروتیوب ها را به مدت 15 ثانیه ورتکس می کنیم.
- کلیه میکروتیوب ها را به مدت 5 دقیقه در دمای c°70  انکوبه می نماییم.
- کلیه میکروتیوب ها را به مدت چند ثانیه سانتریفوژ می نماییم.
- مقدار lμ600  اتانول (٪100-96) به نمونه ها اضافه کرده و پس از 15 ثانیه ورتکس کردن به مدت چند ثانیه سانتریفوژ می کنیم.                
تا پایان این مرحله "lysed sample" تهیه شده است.
- به ازای هر میکروتیوب یک ستون Ribo virus  را بر روی یک لوله ml2 قرار داده و شماره گذاری می کنیم.
- مقدارlμ700 از lysed sample  مرحله 12 را داخل ستون می ریزیم.
- کلیه ستون ها را در همان وضعی که بر روی لوله قرار دارند به مدت 1 دقیقه با نیرویg   8000  می نماییم.
- لوله های زیرین را دور ریخته و ستون ها را بر روی لوله های جدید قرار می دهیم.
- به هر ستون مقدار lμ500 از بافر RAW اضافه کرده و کلیه ستون ها را به همراه لوله ها به مدت 1 دقیقه با نیرویg 8000  سانتریفوژ می کنیم.
- لوله های زیرین را دور ریخته و ستون ها را بر روی لوله های جدید قرار می دهیم.
- به هر ستون مقدار lμ600 از بافر RAV3 اضافه کرده و کلیه ستون ها را به همراه لوله ها به مدت 1 دقیقه با نیرویg 8000  سانتریفوژ می کنیم.
- لوله های زیرین را دور ریخته و ستون ها را بر روی لوله های جدید قرار می دهیم.
- به هر ستون مقدار lμ200 از بافر RAV3 اضافه کرده و کلیه ستون ها را به همراه لوله ها به مدت 5 دقیقه با نیرویg 11000 سانتریفوژ می کنیم. در اثر این سانتریفوژ ، بافر اتانولی RAV3 کاملا از ستون خارج می گردد.
-کلیه لوله های زیرین را دور ریخته و ستون ها را با درب باز به مدت 1 دقیقه در دمای c°70  انکوبه می کنیم تا مقادیر بسیار جزئی اتانول نیز از ستون خارج گردد.
-هر ستون Ribo virus  را بر روی یک میکروتیوب 1.5ml  استریل قرار می دهیم.
- مقدار 50μl  از محلول Rnase free H2O  که از قبل به مدت 1 دقیقه در دمای  c°70  حرارت دیده است به هر ستون اضافه می کنیم.
- کلیه میکروتیوب های حاوی ستون را به مدت 1 دقیقه با نیروی g 11000 سانتریفوژ نمایید.
مایع جمع شده در میکروتیوب فراورده ایست که آزمایش PCR  بر روی آن انجام می گیرد، در این مرحله استخراج خاتمه میابد. بنابر توصیه مندرج در بروشور کیت مراحل بعدی PCR  که شامل Amplification  و  Detection می باشد ترجیحا می بایست در همان روزی انجام گردد که Extraction  انجام می پذیرد.

آماده سازی دستگاه:
- هود (مخصوص انجام مرحله Extraction ): 1 ساعت قبل از شروع انجام Extraction  کلیه لوازم موجود در این هود را با استفاده از گاز استریل و الکل 96٪ استریل می کنیم و سپس به مدت 30 دقیقه لامپ UV هود را روشن کرده و از اتاق خارج می شویم تا هرگونه اسید نوکلئیک اضافی موجود در زیر هود تخریب شود.
- دستگاه Dry-block  :همزمان با آغاز انجام Extraction  این دستگاه را روشن و روی دمای c°70  تنظیم می کنیم.
- سانتریفوژ یخچال دار: همزمان با آغاز انجام Extraction   سانتریفوژ را روشن می کنیم تا دمای یخجال آن به دمای قابل قبول جهت مراحل سانتریفوژ Extraction  برسد.
- ورتکس: ورتکس را روی حالت Touch  قرار می دهیم و روی درجه مربوط به ورتکس کردن میکروتیوب که درجه 5  است قرار می دهیم.

آماده سازی کیت :
کیت Extraction  در دمای اتاق نگه داری می شود.
- آماده سازی محلول RAV1 : 1 سی سی از بافر RAV1 را داخل ویال محتوی Carrier RNA ریخته و پس از حل شدن کامل آن، کلیه محتویات این ویال را مجددا به قوطی محتوی بافر RAV1  برگردانده و پس از بستن درب آن، چند بار این قوطی را سرو ته می نماییم. جهت نگه داری طولانی مدت این محلول داخل ویال های پلاستیکی درب دار استریل تقسیم می کنیم و در دمای فریزر نگه داری می کنیم. چنانچه این محلول را از قبل تهیه و در فریزر داده ایم در زمان آماده سازی کیت باید آن را در دمای c°70  قرار دهیم تا ذوب شده و کریستالهای آن به حالت محلول در آمده و هموژن شود.
- آماده سازی بافر RAV3 : این بافر آماده مصرف می باشد و در دمای اتاق قرار می گیرد.
- آماده سازی بافر RAV3 : 50ml  اتانول 100-96٪ را به ویال بافر RAV3 اضافه می کنیم و این نحلول تا پایان یافتن کیت آماده مصرف است و در دمای اتاق نگه داری می شود.
- حدود 2 سی سی اتانول خالص را در لوله استریل ریخته و در دمای اتاق نگه داری می کنیم.
- آب دیونیزه استریل را قبل از مصرف در دمای c°70  قرار می دهیم.
- ستون ها را به تعداد مورد نیاز آماده می کنیم.

آماده سازی نمونه:
همه انواع مایعات بیولوژیک یا نمونه های شبه مایع مانند سرم، ادرار، BAL، می توانند جهت Extraction استفاده شوند.
جهت انجام تخلیص کامل اسیدنوکلئیک به دست آوردن یک نمونه عاری از ویسکوزیته، شفاف و هموژن قبل از بردن نمونه روی ستون های Ribovirus بسیار حائز اهمیت است. بنابراین تمام نمونه ها را از نظر وجود هر گونه رسوب چک کنید. نمونه های شفاف را قبل از مرحله لیز با RAV1   سانتریفوژ نکنید زیرا ویروس ها تمایل دارند با ذرات موجود در نمونه تجمع یابند.
نمونه سرم و پلاسما به مدت 6 ساعت در دمای یخچال (  c°8-2)  قابل نگه داری هستند. جهت نگه داری طولانی تر باید نمونه را در فریزر   (c°80-20-) قرارداد. نمونه های فریز شده نباید بیش از یک بار ذوب و فریز مجدد شود.
ذوب و فریزهای مکرر موجب تخریب اسید نوکلئیک و رسوب پروتئین ها می شود و در نتیجه موجب کاهش کاذب Viral load  می شود.نمونه هایی که حاوی سلول هستند مثل مایع مغزی- نخاعی، مغز استخوان، ادرار، و سواپ های حاوی نمونه، باید ابتدا فیلتر شوند یا 10 دقیقه با نیروی g 1500 سانتریفوژ شده و مایع رویی استفاده شود.
 
 علل رد نمونه :
- نامناسب بودن نمونه از نظر نوع (بجای سرم نمونه پلاسما باشد ) و یا حجم نمونه
- وجود عوامل مداخله گردر نمونه سرم یا پلاسما همانند نمونه هایی که همولیز هستند یا همراه با گلبولهای قرمز هستند
- وجود فیبرین در سرم


ادامه دارد ...

 

فرهیخته آزمایشگاهی گرامی:

با سلام و درود

احتراما با تشکر از بازدید  شما از نسخه دموی نرم افزار استانداردسازی و کنترل کیفیت    NextLab 

معروض میدارد امکان رویت متن کامل مستندات فقط در لینک های زیر میسر است

و دسترسی به متن کامل سایر مستندات فقط در نسخه اصلی امکان پذیر است

دستورالعمل مدیریت پسماندها

دستورالعمل کاربری دستگاه سل کانتر

دستورالعمل روش انجام آزمایش CBC

شرح وظايف کارکنان نظافت، شستشو و استرلیزاسیون

روش اجرانی ممیزی داخلی

دستورالعمل آماده سازي و اطلاع رساني بيماران جهت نمونه گيري صحيح


با سپاس از بذل توجه شما


نرم افزار مستندات، استانداردسازی و کنترل کیفیت نِکست لَب [ www.NextLab.ir ]