دستورالعمل روش صحیح انجام آزمایش HBV Real-TM Quant

کد سند:
408
کد یکتا:
168
واحد سازمانی:
ژنتیک و بیولوژی مولکولی
فرآیند:
فرآیند انجام آزمایش
زمان ویرایش:
1395/01/24
ویرایش کننده:
مدیر ارشد آزمایشگاه
شماره بازنگری:
1.0
ضمیمه - مرجع:
توضیحات:

متن سند:
 
HBV Real-TM Quant
هدف :
حصول اطمینان از انجام روش صحیح  اندازه گیری و گزارش میزان کمی  HBV DNA  از مایعات بیولوژیک می باشد.

دامنه کاربرد :
این دستورالعمل جهت اندازه گیری و گزارش میزان کمی HBV DNA از مایعات بیولوژیک نظیر سرم، پلاسما، ادرار، مایع مغزی-نخاعی، مغز استخوان و نمونه های تهیه شده بوسیله سوآب در بخش تشخیص مولکولی و PCR آزمایشگاه کاربرد دارد.

صلاحیت و شایستگی کاربر : 
-مسئولیت تایید و تصویب این دستورالعمل بر عهده مسئول فنی بخش تشخیص مولکولی آزمایشگاه می باشد .
-مسئولیت نظارت بر حسن اجرای این دستور العمل بر عهده مسئول بخش تشخیص مولکولی می باشد .
-جهت حصول اطمینان از  انجام روش صحیح اندازه گیری میزان کمی HBV DNA   توسط پرسنل بخش تشخیص مولکولی ، قرائت کامل این  دستــور العمل  همراه با گذراندن دوره آموزشی به مدت یک هفته تحت نظر مسئول بخش الزامی است .

اقدامات وابسته : 
-آگاهی از اساس جداسازی اسیدهای نوکلئیک
- آگاهی از عوامل جداسازی اسیدهای نوکلئیک و نیز عوامل مداخله گر
- آگاهی از برنامه کنترل کیفی در آزمایشگاه
- آگاهی از روشهای محلول سازی در آزمایشگاه

اطلاعات نمونه : 
-  نوع نمونه : باتوجه به کیت های مصرفی جهت استخراج اسید نوکلئیک انواع نمونه های مورد گزارش عبارتند از:
- نمونه سرم غیر همولیز فاقد فیبرین که ترجیحا لیپمیک هم نباشد، برای جداسازی سرم نمونه خون بیمار را که در لوله لخته ژل دار SST  گرفته شده است به مدت 5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ نمایید و بدون استفاده از سمپلر سرم را جدا نموده و داخل یک لوله پلاستیکی نو شفاف درب دار که برای این منظور قبلا استریل شده است نگهداری نمایید.
-نمونه پلاسما غیر همولیز که ترجیحا لیپمیک هم نباشد برای جداسازی پلاسما نمونه خون بیمار را که در لوله محتوی ضد انعقاد EDTA یا سیترات گرفته شده است (ضد انعقاد هپارین برای آزمایش های مولکولی و PCR قابل قبول نمی باشد) به مدت  5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ نمایید و با استفاده از سمپلر، پلاسما را جدا نموده و داخل یک لوله پلاستیکی نو شفاف درب دار که برای این منظور قبلا استریل شده است نگهداری نمایید.
- نمونه ادرار تصادفی یا 24 ساعته که ترجیحا سانتریفوژ شده باشد .
-نمونه خلط و سایر مایعات بیولوژیک
-نمونه خون کامل
-سلول های تک هسته ای جدا شده از خون محیطی(PBMC)
-نمونه بیوپسی از بافت های مختلف
توجه: مایعات بیولوژیک نظیر ادرار، CSF، مغز استخوان و نمونه های گرفته شده توسط سوآب قبل از هر چیز می بایست  به مدت  5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ گردند و مایع حاصل رویی که فاقد سلول است مورد آزمایش قرار بگیرد.
- شرایط ظاهری نمونه :
- نمونه سرم یا پلاسما باید فاقد همولیز بوده و در صورت لیپمیک یا ایکتریک بودن ، در نتیجه نهایی قید گردد .
- نمونه ادرار می بایست شفاف بوده و در غیر اینصورت سانتریفوژ گردد .
-  حجم نمونه  :
 حجم نمونه جهت انجام PCR با توجه به دستورالعمل کیت مربوطه تعیین می شود.
 -  نحوه ذخیره سازی نمونه :
شرایط نگهداری نمونه با توجه به نوع نمونه و دستورالعمل کیت مربوطه تعیین می شود.
 
لوازم مورد نیاز : 
- لوله های پلاستیکی نو درب دار استریل
-سمپلرهای اختصاصی    
-سر سمپلر ترجیحا  از نوع فیلتردار و فاقد DNA, RNA
- میکروتیوب های استریل و فاقد DNA, RNA با حجم 1.5ml
-میکروسانتریفوژ ترجیحا یخچال دار
-هود بیولوژیک اختصاصی مجهز به فن قوی و لامپ UV
-Dry-Block  با قابلیت تنظیم در دمای مختلف
- ورتکس
- تایمر دیجیتال
- پیپت فیلر اتوماتیک
- پیپت های 5 تا 10 سی سی استریل
-دستکش
-رک میکروتیوب اختصاصی
- ظرف Safty Box  اختصاصی
- یخچال، فریزر
- دستگاه Real Time Thermal cycler

 محلول های مورد نیاز و شرایط نگهداری آنها : 
- اتانول با درجه خلوص 100-96  درصد که به صورت تجاری در دسترس می باشد.
- اتانول با درجه خلوص 70  درصد که به صورت تجاری در دسترس است.
- سدیم هیپوکلریت (آب ژاول) با غلظت 5 درصد که برای تهیه آن آب ژاول را که به صورت تجاری در دسترس می باشد با استفاده از آب دیونیزه استریل به میزان 20/1 رقیق می نماییم، این محلول ناپایدار بوده و می بایست در هنگام نیاز تهیه شود.
- سدیم هیپوکلریت (آب ژاول) با غلظت 5/0 درصد که برای تهیه آن آب ژاول را که به صورت تجاری در دسترس می باشد با استفاده از آب دیونیزه استریل به میزان 200/1 رقیق می نماییم، این محلول ناپایدار بوده و می بایست در هنگام نیاز تهیه شود.
 
اساس کار کیت HBV Real-TM Quant
کیت HBV بر اساس روش Real Time  است که جهت تشخیص کمی ویروس هپاتیت B در پلاسما یا سرم انسان و نیز تشخیص کنترل داخلی، بوسیله دو رنگ فلورسانس  به کار می رود.
وجه افتراق Real Time PCR با PCR معمولی به کار گرفتن یک نشانگر فلورسنت در واکنش جهت ردیابی محصول واکنش می باشد. این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر DNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه (Threshold)باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی داری دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد.  به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانه­ای می رسد که به مقدارمشخصی از سطح background  بالاتر است،  چرخه مزبور ( سیکلی از PCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبورمیکند)به عنوان CT شناخته می شود.

به طور کلی  Real time PCR  چند مرحله دارد که عبارت است از:
1- Baseline region : در این مرحله هیچ گونه نوری قابل رویت نیست.
2-  Exponential phase : محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد تصاعدی مربوط به واکنش  آغاز می شود.
3- The liner phase: در این مرحله ترکیبات واکنش و کارایی آنها روبه اتمام است.
4- The plateau phase: در این مرحله ترکیبات واکنش از بین می روند و افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.

روشReal time PCR  می تواند به دو صورت One step ( همزمان در یک واکنش ساخت cDNA از RNA و تکثیر آن صورت می گیرد) و Two step ( ابتدا ساخت cDNA و در واکنش دیگر تکثیر آن ) انجام میشود.

آنالیزهای کمی درPCR Real time
در این روش از نمونۀ RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (260 nm) تعیین می‌شود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های آن تبدیل می‌شود. استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است هرچند که بسیار گران قیمتند. از نمونه های استاندارد سری رقت تعیین کرده و همراه با نمونه هدف در دستگاه Real-time PCR قرار می دهیم.  با استفاده از Ctکه دستگاه برای هر رقت به ما می دهد، یک منحنی رسم کرده که X آن رقت یا تعداد کپی از ژن و Y آن CT باشد، نمودار به دست آمده یک نمودار خطی است که با قرار دادن عدد نمونه هدف در نمودار، غلظت یا تعداد کپی آن نیز بدست می آید. ترجیحا طول قطعه استاندارد مساوی با طول قطعه هدف باشد.             
 
روش انجام آزمایش:
- به تعداد مورد نیاز میکروتیوب درب دار مخصوص دستگاه  را بر روی    Cooling Block که به دمای یخچال رسیده و تازه آن را از یخچال خارج کرده ایم قرار میدهیم.
سه میکروتیوب برای استانداردهای HBV
سه میکروتیوب برای استانداردهای کنترل داخلی
یک میکروتیوب برای Negative control of PCR 
یک میکرو تیوب برای Negative control of extraction 
دو میکروتیوب برای positive control of extraction 
به تعداد بیماران هم میکروتیوب می گذاریم.
12.5  میکرولیتر از Master mix  را در تمامی میکروتیوب ها Sample  می کنیم.
12.5 میکرولیتر از استانداردها، کنترل ها و نمونه های بیمار را در میکروتیوب های مخصوص خود sample  می کنیم.
-دستگاه Smart cycler  و کامپیوتر متصل به آن را روشن کرده و وارد برنامه مربوط به دستگاه می شویم.
- سپس میکروتیوب ها را سانتریفوژ کرده و هر یک را در جایگاه مخصوص به خود در دستگاه smartcycler  قرار می دهیم.
- گزینه Creat Run را انتخاب می نماییم.
- سپس  گزینه Copy of protocol  را انتخاب کرده و از بین پروتوکل ها ، پروتوکل مربوط به HBV  را انتخاب می کنیم.
- سپس برنامه مربوط به همان Run کاری را بر اساس ترتیب چینش ویال ها در دستگاه تعریف می کنیم.
- سه جایگاه اول به ترتیب چپ به راست مربوط به        QS1 HBV, QS2 HBV, QS3 HBV و جایگاه 4و5و6  به ترتیب چپ به راست مربوط به QS1 IC, QS2 IC, QS3 IC   می باشد.جایگاه 7 مربوط به Negative control of PCR  و جایگاه 8 مربوط بهNegative control of Extraction می باشد. جایگاه 9و10 مربوط به Positive control 1,2  می باشد. سایر جایگاه مربوط به نمونه های بیماران می باشد.
- پس از اطمینان از صحت اطلاعات وارد شده، گزینه Start  را انتخاب می کنیم.

آماده سازی کیت 
کیت HBV RealTM PCR  در دمای 20- در فریزر نگهداری می شود.
نیم ساعت قبل از شروع آزمایش باید کیت را از فریزر خارج نموده در دمای اتاق قرار دهیم، پس از ذوب شدن محلول ها، آنها را Shake کرده و سپس چند ثانیه سانتریفوژ نموده و پس از آن sampling  را آغاز می کنیم.
- آماده سازی محلول  Mastermix: جهت تهیه Master mix ، 200 میکرولیتر از RT-PCR-mix-2  و نیز 20 میکرولیتر از Hot start  را وارد ویال RT-PCR-mix-1   می کنیم.

علل رد نمونه : 
- نامناسب بودن نمونه از نظر نوع (بجای سرم نمونه پلاسما باشد ) و یا حجم نمونه
- وجود عوامل مداخله گردر نمونه سرم یا پلاسما همانند نمونه هایی که همولیز هستند یا همراه با گلبولهای قرمز هستند
- وجود فیبرین در سرم
- عدم درج مشخصات کافی بر روی لیبل نمونه
- استفاده از لوله های غیر نو (چند بار مصرف شده ) برای جدا سازی نمونه های سرم و یا ارسال آن
- استفاده از در پوش های نا مناسب برای لوله های محتوی نمونه و نشت نمونه به خارج از لوله و در همین ارتباط لازم بذکر است که استفاده از پارافیلم جهت مسدود کردن درب لوله های محتوی نمونه های سرم یا ادرار عملی است غیر استاندارد و منسوخ شده
-عدم نگه داری نمونه در دمای مناسب (در فریزر و یا یخچال)
- نمونه ای که حاوی ضد انعقاد هپارین است قابل استفاده نمی باشد.
ادامه دارد ...

 

فرهیخته آزمایشگاهی گرامی:

با سلام و درود

احتراما با تشکر از بازدید  شما از نسخه دموی نرم افزار استانداردسازی و کنترل کیفیت    NextLab 

معروض میدارد امکان رویت متن کامل مستندات فقط در لینک های زیر میسر است

و دسترسی به متن کامل سایر مستندات فقط در نسخه اصلی امکان پذیر است

دستورالعمل مدیریت پسماندها

دستورالعمل کاربری دستگاه سل کانتر

دستورالعمل روش انجام آزمایش CBC

شرح وظايف کارکنان نظافت، شستشو و استرلیزاسیون

روش اجرانی ممیزی داخلی

دستورالعمل آماده سازي و اطلاع رساني بيماران جهت نمونه گيري صحيح


با سپاس از بذل توجه شما


نرم افزار مستندات، استانداردسازی و کنترل کیفیت نِکست لَب [ www.NextLab.ir ]