دستورالعمل HBV Real-TM Quant

کد سند:
کد یکتا:
367
واحد سازمانی:
ژنتیک و بیولوژی مولکولی
فرآیند:
فرآیند انجام آزمایش
زمان ویرایش:
1395/01/24
ویرایش کننده:
مدیر ارشد آزمایشگاه
شماره بازنگری:
2.0
ضمیمه - مرجع:
توضیحات:

متن سند:
هدف :

    هدف از تدوین این دستورالعمل حصول اطمینان از انجام روش صحیح  اندازه گیری و گزارش میزان کمی  HCV RNA  از مایعات بیولوژیک می باشد.

دامنه کاربرد :

این دستورالعمل جهت اندازه گیری و گزارش میزان کمی HCV RNA از مایعات بیولوژیک نظیر سرم، پلاسما، ادرار، مایع مغزی-نخاعی، مغز استخوان و نمونه های تهیه شده بوسیله سوآب در بخش تشخیص مولکولی و PCR آزمایشگاه کاربرد دارد.

مراجع و منابع :


Sacace Biotechnologies
Ribo Virus (HCV Real-TM Quant)
User Manual

مسئولیت و اختیارات / صلاحیت و شایستگی کاربر :

مسئولیت تهیه این دستورالعمل بر عهده کمیته مستند سازی و آموزش آزمایشگاه  می باشد .
مسئولیت تایید و تصویب این دستورالعمل بر عهده مسئول فنی بخش تشخیص مولکولی آزمایشگاه می باشد .
مسئولیت نظارت بر حسن اجرای این دستور العمل بر عهده مسئول بخش تشخیص مولکولی می باشد .
از آنجاییکه از این دستگاه در حوزه عملکردی بخش تشخیص مولکولی استفاده می گردد لذا تمامی موارد مربوط به صلاحیت و شایستگی پرسنل بخش تشخیص مولکولی می بایست رعایت گردد .
جهت حصول اطمینان از  انجام روش صحیح اندازه گیری میزان کمی HCV RNA   توسط پرسنل بخش تشخیص مولکولی ، قرائت کامل این  دستــور العمل  همراه با گذراندن دوره آموزشی به مدت یک هفته تحت نظر مسئول بخش الزامی است .
مسئولیت نگهداری این دستور العمل بر عهده مسئول بخش تشخیص مولکولی و مسئول دفتر بهبود کیفیت و بهره وری است .
مسئولیت بازنگری و اعمال تغییر در این دستور العمل با رعایت مراجـــع و ضوابط استـــاندارد برعــهده مسئول فنی  بخش تشخیص مولکولی ( و کمیته مستند سازی و آموزش تحت نظر ایشان ) می باشــد و هریک از مسئـــولیــن و کــاربران مرتبط می توانند پیشــنهاد بازنـــگری و تغیـــیر در دستـــورالــعمل را بنــمایند .
 
اقدامات وابسته :

آگاهی از عوامل جداسازی اسیدهای نوکلئیک و نیز عوامل مداخله گر
آگاهی از برنامه کنترل کیفی در آزمایشگاه
 آگاهی از روشهای محلول سازی در آزمایشگاه
آگاهی از نحوه نگهداری نمونه ها پس از انجام آزمایش
آگاهی از اصول ایمنی در آزمایشگاه و دستورالعمل های دفع پسماند
 
اطلاعات نمونه :

نوع نمونه : باتوجه به کیت های مصرفی جهت استخراج اسید نوکلئیک انواع نمونه های مورد گزارش عبارتند از: نمونه سرم غیر همولیز فاقد فیبرین که ترجیحا لیپمیک هم نباشد، برای جداسازی سرم نمونه خون بیمار را که در لوله لخته ژل دار SST  گرفته شده است به مدت 5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ نمایید و بدون استفاده از سمپلر سرم را جدا نموده و داخل یک لوله پلاستیکی نو شفاف درب دار که برای این منظور قبلا استریل شده است نگهداری نمایید.
6-1-2-نمونه پلاسما غیر همولیز که ترجیحا لیپمیک هم نباشد برای جداسازی پلاسما نمونه خون بیمار را که در لوله محتوی ضد انعقاد EDTA یا سیترات گرفته شده است (ضد انعقاد هپارین برای آزمایش های مولکولی و PCR قابل قبول نمی باشد) به مدت  5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ نمایید و با استفاده از سمپلر، پلاسما را جدا نموده و داخل یک لوله پلاستیکی نو شفاف درب دار که برای این منظور قبلا استریل شده است نگهداری نمایید.
نمونه ادرار تصادفی یا 24 ساعته که ترجیحا سانتریفوژ شده باشد .
نمونه خلط و سایر مایعات بیولوژیک
نمونه خون کامل
-سلول های تک هسته ای جدا شده از خون محیطی(PBMC)
نمونه بیوپسی از بافت های مختلف
توجه: مایعات بیولوژیک نظیر ادرار، CSF، مغز استخوان و نمونه های گرفته شده توسط سوآب قبل از هر چیز می بایست                به مدت  5 تا 10 دقیقه با نیروی  1500-2700 g (معادل 2900-3900 RPM) سانتریفوژ گردند و مایع حاصل رویی که فاقد سلول است مورد آزمایش قرار بگیرد.
 شرایط ظاهری نمونه :
نمونه سرم یا پلاسما باید فاقد همولیز بوده و در صورت لیپمیک یا ایکتریک بودن ، در نتیجه نهایی قید گردد .
نمونه ادرار می بایست شفاف بوده و در غیر اینصورت سانتریفوژ گردد .
حجم نمونه  :
حجم نمونه جهت انجام PCR با توجه به دستورالعمل کیت مربوطه تعیین می شود.
 
  نحوه ذخیره سازی نمونه :
شرایط نگهداری نمونه با توجه به نوع نمونه و دستورالعمل کیت مربوطه تعیین می شود.
 
تجهیزات و لوازم مورد نیاز :

لوله های پلاستیکی نو درب دار استریل
 سمپلرهای اختصاصی ( مخصوص PCR ) در سایزهای مختلف
سر سمپلر ترجیحا  از نوع فیلتردار و فاقد DNA, RNA
 میکروتیوب های استریل و فاقد DNA, RNA با حجم 1.5ml
-میکروسانتریفوژ ترجیحا یخچال دار
هود بیولوژیک اختصاصی مجهز به فن قوی و لامپ UV
Dry-Block  با قابلیت تنظیم در دمای مختلف
- ورتکس
تایمر دیجیتال
 پیپت فیلر اتوماتیک
پیپت های 5 تا 10 سی سی استریل
دستکش های بدون پودر ترجیحا از جنس وینیل
رک میکروتیوب اختصاصی
ماژیک اختصاصی
ظرف Safty Box  اختصاصی
یخچال، فریزر
دستگاه Real Time Thermal cycler
فضای کار اختصاصی و مجزا جهت انجام آزمایش
 
محلول های مورد نیاز و شرایط نگهداری آنها :

اتانول با درجه خلوص 100-96  درصد که به صورت تجاری در دسترس می باشد.
 اتانول با درجه خلوص 70  درصد که به صورت تجاری در دسترس است.
- سدیم هیپوکلریت (آب ژاول) با غلظت 5 درصد که برای تهیه آن آب ژاول را که به صورت تجاری در دسترس می باشد با استفاده از آب دیونیزه استریل به میزان 20/1 رقیق می نماییم، این محلول ناپایدار بوده و می بایست در هنگام نیاز تهیه شود.
سدیم هیپوکلریت (آب ژاول) با غلظت 5/0 درصد که برای تهیه آن آب ژاول را که به صورت تجاری در دسترس می باشد با استفاده از آب دیونیزه استریل به میزان 200/1 رقیق می نماییم، این محلول ناپایدار بوده و می بایست در هنگام نیاز تهیه شود.
 
اساس کار کیت HCV Real-TM Quant:

کیت HCV بر اساس روش Real Time  است که جهت تشخیص کمی ویروس هپاتیت C در پلاسما یا سرم انسان و نیز تشخیص کنترل داخلی، بوسیله دو رنگ فلورسانس  به کار می رود.
وجه افتراق Real Time PCR با PCR معمولی به کار گرفتن یک نشانگر فلورسنت در واکنش جهت ردیابی محصول واکنش می باشد. این گزارش‌گرها به گونه‌ای طراحی می‌شوند که در صورت تکثیر RNA نور تولید کنند. لذا افزایش شدت نور ثبت شده در دستگاه با میزان محصول بدست آمده نسبت مستقیم دارد. به اولین چرخه‌ای که شدت فلورسنت بیشتر از خط پایه (Threshold)باشد چرخۀ آستانه یا CT گویند. عدد CT با مقدار الگوی اولیه رابطۀ معنی داری دارد و از روی آن می‌توان مقدار mRNA اولیه را تخمین زد.  به عبارت دیگر در فاز اولیه مرحله تصاعدی مقدار فلورسنت افزایش می یابد تا به آستانه­ای می رسد که به مقدارمشخصی از سطح background  بالاتر است،  چرخه مزبور ( سیکلی از PCR که قطعه تکثیر از حد آستانه عبورمیکند)به عنوان CT شناخته می شود.


به طور کلی  Real time PCR  چند مرحله دارد که عبارت است از:
 Baseline region : در این مرحله هیچ گونه نوری قابل رویت نیست.
 Exponential phase : محصول دو رشته ای در هر چرخه دو برابر می شود و رشد تصاعدی مربوط به واکنش  آغاز می شود.
The liner phase: در این مرحله ترکیبات واکنش و کارایی آنها روبه اتمام است.
The plateau phase: در این مرحله ترکیبات واکنش از بین می روند و افزایشی در میزان فلورسنت مشاهده نمی شود.

 روشReal time PCR  می تواند به دو صورت One step ( همزمان در یک واکنش ساخت cDNA از RNA و تکثیر آن صورت می گیرد) و Two step ( ابتدا ساخت cDNA و در واکنش دیگر تکثیر آن ) انجام میشود.

 رنگ­های فلورسنت متصل شونده به DNA :

 شاید متداولترین رنگ مورد استفاده در این تکنیک سایبرگرین باشد. این رنگ به شیارهای کوچک DNA دورشته‌ای متصل می‌شود و با جذب در طول موج 498 نانومتر، نور 522 نانومتری را ساطع می‌کند که توسط دستگاه ثبت می‌شود. در طی  PCR که محصول دو رشته ای تولید می­شود، رنگ به آنها متصل می شود و بنابراین افزایش شدت فلورسنت با غلظت dsDNA متناسب است. سایبرگرین یک رنگ غیر اختصاصی است لذا برای تمامی آزمایشات قابل استفاده است و این مسئله یک مزیت به شمار می‌آید. اگرچه مهمترین عیب آن عدم توانایی در افتراق DNA      دو رشته ای اختصاصی از پرایمر دایمر ها می باشد که برای حل این مشکل استفاده از منحنی ذوب (Melting curve) پس از انجام مراحل PCR توصیه شده است.

پروب‌های فلورسنت:
پروب‌ها بر خلاف سایبرگرین I بر اساس تشخیص اختصاصی توالی محصول کار می‌کنند. پروب‌ها معمولاً یک رنگ فلورسنت گزارشگر (Reporter) و یک رنگ خاموش کننده (Quencher) دارند. دستگاه‌ بازتابش رنگ فلورسنت را بررسی می‌نماید .حضور خاموش کننده در نزدیکی موقعیت فلورسنت موجب جذب نور آن و خاموش شدن آن می‌شود لذا در این حالت بازتابشی در دستگاه ثبت نمی‌شود. از جمله این پروب ها می توان به Taqman، scorpion و ... اشاره نمود.
 
آنالیزهای کمی درPCR Real time



در این روش از نمونۀ RNA یا DNA با غلظت مشخص برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود. غلظت RNA یا DNA استاندارد با اسپکتروفوتومتر (260 nm) تعیین می‌شود و سپس از روی وزن مولکولی نمونه به تعداد نسخه‌های آن تبدیل می‌شود. استانداردهای غلظتی ژن‌های معروف به صورت تجاری قابل خریداری است هرچند که بسیار گران قیمتند. از نمونه های استاندارد سری رقت تعیین کرده و همراه با نمونه هدف در دستگاه Real-time PCR قرار می دهیم.  با استفاده از Ct که دستگاه برای هر رقت به ما می دهد، یک منحنی رسم کرده که X آن رقت یا تعداد کپی از ژن و Y آن CT باشد، نمودار به دست آمده یک نمودار خطی است که با قرار دادن عدد نمونه هدف در نمودار، غلظت یا تعداد کپی آن نیز بدست می آید. ترجیحا طول قطعه استاندارد مساوی با طول قطعه هدف باشد.             
 




 
 
 
 



 
معرفی اجزای کیت:

 کیت  HCV Real-TM Quant  که در دمای فریزر قابل نگهداری بوده و شامل اجزاء زیر می باشد:
DTT: یکی از محلول های لازم جهت تهیه Master mix  است، جهت تهیه Master mix ، 300 میکرولیتر از RT-PCR-mix-1 ، 200 میکرولیتر از  RT-PCR-mix-2 ، نیز 20 میکرولیتر از Hot start   و نیز 10 میکرولیتر از M-MLV Revertase  را وارد این ویال می کنیم.
 RT-PCR-mix-1-TM: یکی از محلول های لازم جهت تهیه Master mix  است.(مراجعه به 10-1)
RT-PCR-mix-2-TM : یکی از محلول های لازم جهت تهیه Master mix است.(مراجعه به 10-1)
Hot Start Taq Polymerase : آنزیم مورد نیاز برای انجام واکنش PCR  است، این آنزیم کاملا اختصاصی است و در دمای C°95  در طی 4 دقیقه فعال میشود و یکی از محلول های لازم جهت تهیه Master mix است.(مراجعه به 10-1)
M-MLV Revertase : آنزیم Revertase  است که از روی RNA ، cDNA می سازد،یکی از محلول های لازم جهت تهیه Master mix  است.(مراجعه به 10-1)
 TE-buffer : به عنوان کنترل منفی استفاده می شود.
 استاندارد های HCV: QS1 HCV، QS2 HCV، QS3 HCV این استاندارد ها حاوی غلظت های مشخصی از ژنوم ویروس هپاتیت B می باشند که جهت رسم منحنی استاندارد به کار می روند.
 استاندارد های Internal Control: QS1 IC، QS2 IC، QS3 IC این استاندارد ها حاوی غلظت های مشخصی از کنترل داخلی هستند که جهت رسم منحنی کنترل داخلی به کار می روند.
توجه: شرایط نگهداری کلیه اجزای کیت در دمای فریزر C)°20-) می باشد.
توجه: نیم ساعت قبل از شروع آزمایش باید کیت را از فریزر خارج نموده در دمای اتاق قرار دهیم، پس از ذوب شدن محلول ها، آنها را Shake کرده و سپس چند ثانیه سانتریفوژ نموده و پس از آن sampling  را آغاز می کنیم.

روش انجام مراحل آزمایش/ مراحل انجام کار:

 به تعداد مورد نیاز میکروتیوب درب دار مخصوص دستگاه  را بر روی    Cooling Block که به دمای یخچال رسیده و تازه آن را از یخچال خارج کرده ایم قرار میدهیم.
سه میکروتیوب برای استانداردهای HCV
سه میکروتیوب برای استانداردهای کنترل داخلی
یک میکروتیوب برای Negative control of PCR
یک میکرو تیوب برای Negative control of extraction
دو میکروتیوب برای positive control of extraction
به تعداد بیماران هم میکروتیوب می گذاریم.
12.5  میکرولیتر از Master mix  را در تمامی میکروتیوب ها Sample  می کنیم.
 12.5 میکرولیتر از استانداردها، کنترل ها و نمونه های بیمار را در میکروتیوب های مخصوص خود sample  می کنیم.
-دستگاه Smart cycler  و کامپیوتر متصل به آن را روشن کرده و وارد برنامه مربوط به دستگاه می شویم.
 سپس میکروتیوب ها را سانتریفوژ کرده و هر یک را در جایگاه مخصوص به خود در دستگاه smartcycler  قرار می دهیم.
گزینه Creat Run را انتخاب می نماییم.
سپس  گزینه Copy of protocol  را انتخاب کرده و از بین پروتوکل ها ، پروتوکل مربوط به HCV  را انتخاب می کنیم.
سپس برنامه مربوط به همان Run کاری را بر اساس ترتیب چینش ویال ها در دستگاه تعریف می کنیم.
 سه جایگاه اول به ترتیب چپ به راست مربوط به     QS1 HCV, QS2 HCV, QS3 HCV و جایگاه 4و5و6  به ترتیب چپ به راست مربوط به QS1 IC, QS2 IC, QS3 IC   می باشد.جایگاه 7 مربوط به Negative control of PCR  و جایگاه 8 مربوط به Negative control of Extraction می باشد. جایگاه 9و10 مربوط به Positive control 1,2  می باشد. سایر جایگاه مربوط به نمونه های بیماران می باشد.
توجه: باید دقت شود که غلظت هر استاندارد در ردیف همان استاندارد در جایگاه معلوم شده در دستگاه وارد شود.
توجه: در هر Run  کاری باید شماره همان  Run کاری، تاریخ و LOT Number  مربوط به کیت  Extraction و PCR استفاده شده در همان Run  را وارد نمود.
پس از اطمینان از صحت اطلاعات وارد شده، گزینه Start  را انتخاب می کنیم.

محاسبه نتایج:

برای هر کنترل و نمونه بیمار غلظت HCV DNA  از طریق فرمول زیر محاسبه می شود:
HCV RNA copies/specimen          Coefficient= IU HCV/ml
IC RNA copies/specimen
آماده سازی دستگاه:

طبق مورد 11 آماده سازی دستگاه انجام می شود.
آماده سازی کیت :

کیت HCV RealTM PCR  در دمای 20- در فریزر نگهداری می شود.
نیم ساعت قبل از شروع آزمایش باید کیت را از فریزر خارج نموده در دمای اتاق قرار دهیم، پس از ذوب شدن محلول ها، آنها را Shake کرده و سپس چند ثانیه سانتریفوژ نموده و پس از آن sampling  را آغاز می کنیم.
 آماده سازی محلول  Mastermix: جهت تهیه Master mix ، 300 میکرولیتر از RT-PCR-mix-1 ، 200 میکرولیتر از  RT-PCR-mix-2 ، نیز 20 میکرولیتر از Hot start   و نیز 10 میکرولیتر از M-MLV Revertase  را وارد ویال DTT  می کنیم.
 
آماده سازی نمونه:

نمونه مورد استفاده در این آزمایش، ماده ژنتیکی استخراج شده در مرحله Extraction  است که پروتوکل مربط به استخراج هر تست در مستندات بخش موجود است و می توان به آنها مراجه نمود.
 
 

محدودیت ها / علل رد نمونه :

نامناسب بودن نمونه از نظر نوع (بجای سرم نمونه پلاسما باشد ) و یا حجم نمونه
وجود عوامل مداخله گردر نمونه سرم یا پلاسما همانند نمونه هایی که همولیز هستند یا همراه با گلبولهای قرمز هستند
وجود فیبرین در سرم
عدم درج مشخصات کافی بر روی لیبل نمونه
 استفاده از لوله های غیر نو (چند بار مصرف شده ) برای جدا سازی نمونه های سرم و یا ارسال آن
 
استفاده از در پوش های نا مناسب برای لوله های محتوی نمونه و نشت نمونه به خارج از لوله و در همین ارتباط لازم بذکر است که استفاده از پارافیلم جهت مسدود کردن درب لوله های محتوی نمونه های سرم یا ادرار عملی است غیر استاندارد و منسوخ شده
عدم نگه داری نمونه در دمای مناسب (در فریزر و یا یخچال)
نمونه ای که حاوی ضد انعقاد هپارین است قابل استفاده نمی باشد.
-نمونه خون کامل را نباید فریز نمود.
- نمونه خون کامل باید در دمایc ° 25-2 نگهداری شده و طی 6 ساعت پس از دریافت نمونه مورد آزمایش قرار بگیرد.
 
 
نکات ایمنی:

وجود فضای مجزا جهت تهیه Master mix
 استفاده از نوک سمپلرهای فیلتر دار Dnase/Rnase free  جهت جلوگیری از آلودگی سمپلرها و پس از استفاده حتما در ظرف مخصوص محتوی ماده ضد عفونی کننده دور انداخته شوند.
جهت حفاظت پرسنل از پوشش کامل (روپوش،دستکش ترجیحا دوبل و حتما بدون پودر لاتکس، عینک، کفش آزمایشگاهی روبسته، پوشش سر(کلاه)، ماسک صورت(دهان، بینی)) استفاده گردد.
کلیه سطوح کاری و نیز لوازمی که در راستای انجام تست از آنها استفاده می شود می بایست با الکل اتیلیک 70  درجه به طور کامل استریل گردد.
در صورت بروز هرگونه آلودگی نظیر ریختن نمونه بیماران بر روی سطوح جهت ضد عفونی کردن می بایست از محلول مخصوص ضدعفونی سطوح استفاده نمود در صورت عدم وجود این محلول می توان از محلول 0.5% هیپوکلریت و به دنبال آن اتانول 70 درجه استفاده کرد.
 در زمان انجام آزمایش دمای اتاق با استفاده از اسپیلیت اختصاصی می بایست بین  c° 25-20 تنظیم شده باشد.
در زمان انجام تست از ورود افراد دیگر ممانعت به عمل آید.
 جریان گردش کار یک سویه Extraction     Amplification      Detection  به هنگام استفاده از وسایل و معرف ها رعایت گردد و کلیه این مواد و وسایل می توانند در این جهت جابجا شوند و نه بالعکس، به هیچ وجه وسائلی که در مرحله PCR  مورد استفاده قرار می گیرند به محدوده انجام Extraction  منتقل نگردند.
 کلیه موادی که در جریان انجام تست از آنها استفاده می نمایید در نهایت می بایست داخل یک کیسه اتوکلاو محکم ریخته و پس از پایان کلیه مراحل درب آن را بسته و به بخش استریلیزاسیون تحویل داده شوند.
پس از پایان کلیه مراحل آزمایش، کلیه سطوح را معمولا با الکل 70 درجه ضد عفونی می کنیم در این مرحله نیز با استفاده از لامپ UV ، هود لامینار مخصوص Extraction  و PCR work station را مجددا استریل نمایید.
در جریان انجام تست PCR ، هر گونه سرسمپلر و یا هر وسیله ای که دور انداخته می شود را باید داخل محلول سدیم هیپوکلریت 5٪  قرار داد.
اشکال یابی:

 سیگنال مربوط به Internal control  (کانال FAM) ضعیف Ct> 32)) و یا منفی باشد:
·         PCR مهار شده است،
¬    از انجام صحیح مراحل استخراج مطمئن شوید و مجددا دستورالعمل آن را مطالعه کنید.
¬    تمام لوله ها را قبل از Sample کردن RNA استخراج شده، دوباره 2 دقیقه با سرعت (12000-16000)  سانتریفوژ کنید، مراقب باشید که رسوب لوله ها تخریب و آلوده نشوند.
·         شرایط نگهداری Reagent  ها مطابق با دستورالعمل نبوده است:
¬    شرایط نگهداری را دوباره چک کنید.
·         شرایط انجام PCR  مطابق با دستورالعمل نبوده است:
¬    شرایط انجام PCR  را دوباره چک کنید و کانال انتخابی برای کنترل داخلی را دوباره انتخاب کنید.
·         در مرحله Sampling اولیه، کنترل داخلی Sample نشده است.
¬    به پروسه استخراج مجددا دقت کنید و آن را مرور کنید.
 سیگنال مربوط به  control  Positive، ضعیف Ct> 32)) و یا منفی باشد:
·         شرایط انجام PCR  مطابق با دستورالعمل نبوده است:
¬    پروسه همانندسازی را مرور کرده و کانال فلورسانس مورد استفاده را دوباره مشخص کنید.
 هر گونه سیگنالی که در کنترل منفی استخراج مشاهده شود:
·         آلودگی در طی استخراج ایجاد شده است، همه نمونه ها نا معتبر هستند:
¬    تمام سطوح و ابزار را با سدیم هیپوکلریت و اتانول  استریل کنید.
¬    فقط از سرسمپلرهای فیلتر دار برای انجام مراحل مختلف استفاده کنید و از لوله به لوله سرسمپلر را عوض کنید.
¬    مرحله استخراج را با ست جدیدی از محلول های استخراج انجام دهید.
 هر گونه سیگنالی که در کنترل منفی PCR مشاهده شود:
·         آلودگی در طی استخراج ایجاد شده است، جواب همه نمونه ها نا معتبر هستند:
¬    تمام سطوح و ابزار را با سدیم هیپوکلریت و اتانول و یا استریل کننده های مخصوص RNA  /DNA  استریل کنید.
¬    کنترل مثبت را در مرحله آخر Sample کنید.
¬    مرحله  PCR را با ست جدیدی از محلول های استخراج انجام دهید.
 
 
مستندات مرتبط :  

فرم ثبت عدم انطباق و انجام اقدامات اصلاحی و پیشگیرانه
فرم پیشنهاد جهت بازنگری و تغییر در مستندات سیستم کیفیت
 
محدوده قابل اندازه گیری توسط کیت:

این کیت در محدوده 250-50,000,000 IU/ml  خطی است.نتایج بیشتر از 50,000,000 IU/ml بالاتر از محدوده قابل تشخیص کیت هستند و باید"بیشتر از 50,000,000 "گزارش شوند، در صورت برخورد با چنین جواب هایی نمونه باید 1/10 با یک سرم منفی رقیق شده و آزمایش تکرار شود.
چنانچه جواب کمتر از 250 copies/ml  شود، کمتر از محدوده قابل تشخیص کیت است و باید کمتر از 250 گزارش شود.
 
 
علل تکرار آزمایش:

کلیه آزمایش هایی که نتیجه آنها خارج از محدوده رفرانس باشند، ترجیحاً تکرار می شوند.
کلیه آزمایش هایی که نتایج کنترل کیفی مربوط به آنها مردود می گردد، حتماً تکرار می شوند.
کلیه آزمایش هایی که نتایج آنها با سایر آزمایش های مرتبط تطابق نداشته باشند، ترجیحاً تکرار می شوند.
کلیه آزمایش هایی که نتایج آنها با شرایط بالینی بیمار تطابق نداشته باشند، ترجیحاً تکرار می شوند.
کلیه آزمایش هایی که با نظر سوپروایزر و یا مسؤول فنی نیاز به تکرار داشته باشند، حتماً تکرار می شوند.
 

نرم افزار مستندات، استانداردسازی و کنترل کیفیت نِکست لَب [ www.NextLab.ir ]